Preparát: Mikroskopování výtrusů

[Bob]

Už jsem jich několik desítek dělal a tak se tu podělím o své postřehy. Třeba to někomu pomůže, třeba mi někdo poradí jak na to lépe a radostněji


Výtrusy jsem doposud získával výhradně tak, že jsem posadil plodnice výtrusorodou vrstvou na podložní sklíčko, přiklopil skleničkou a počkal do rána. Výhodou je, že se sklíčko s výtrusným prachem dá přenést na libovolný podklad a lépe tak odpozorovat jeho barvu.
Na podložní sklíčko se mi vejdou s rezervou tři krycí sklíčka a tak si obvykle nanesu kapku Melzerova činidla, kapku kongočerveni a kapku bavlníkové modři v laktofenolu. Říkám tomu semafor. Někdy použiji místo kongočerveni vodu a nebo na doporučení Mata dětský šampón. Přiklopím opatrně krycí sklíčka jemně přitlačím a jdu mikroskopovat.

Postřehy:

0. Dávkování kapiček
Všelijaké kapátka, co jsem potkal mi dělají moc velké kapky a je pak potřeba odsávat čímž se obvykle ztratí i mnoho výtrusů. Jako dokonalé mi přijdou malinké stříkačky (1 mL, tzv. tuberkulinky) s tenoučkou jehlou. Tím se dá perfektě nadávkovat (při troše zkušeností) přesně tolik, kolik je potřeba.

1. Přimáčknutí sklíčka
Sklíčko je potřeba nepřitlačovat silou velkou neboť se ty výtrusy dají vcelku snadno rozmačkat. To jsem zpočátku fakt netušil a mnoho vzorků jsem musel dělat znovu Někde jsem viděl, že používají k přitlačení sklíčka obyčejnou tužku s gumou na konci - tedy tou gumou. Zkoušel jsem to, jde to vcelku fajn. Když se to přežene s množstvím média, je vhodné ho zároveň při tlačení na sklíčko odsávat pojákem či nějakým filtračním papírem či buničinou či papírový kapesníkem či tak něco.

2. Melzerovo činidlo
Dává odpověď o amyloiditě výtrusů a je tedy nezbytné neboť tím lze pokročit při určování. V případě amylodiní reakce zvýrazní ornamentiku natolik, že ji lze parádné vidět (holubinky, ryzce). Pokud je reakce jiná, pak je ornamentika obvykle jen obtížně pozorovatelná. Dobré je také v tom, že jsou v něm výtrusy poměrně méně pohyblivé a dají se tedy lépe fotit. Nejlepší je, když kolem sklíčka trochu činidla "vyčnívá" (jen tak jakože vlhko). Po několika minutách zaschne a pohyb výtrusů někdy téměř zamrzne a to je pak pohoda fotit. V Melzerovy obvykle nelze pozorovat septa, a tukové kapky jsou vidět taky jen obtížně. Ani případný fázový kontrast toho moc neodhalí.

3. Kongočerveň - Congo Red
Velmi dobře se v něm pozorují tukové kapky. Septa obvykle vidět nejsou. Často vidím, že některé výtrusy se barví a jiné nikoli. Typuji, že je to dané stářím výtrusů (obvykle mi přišlo, že starší se nebarví a mladší ano. Jindy jsem viděl, že v barevných výtrusech běhají nějaké bakterie, zatímco v nebarevných nikoli. Zatím používám 1% vodný roztok, ale mám v plánu použít klasiku, tj. v roztoku hydroxidu (louhu) nebo amoniaku. Prý to zabraňuje srážení kongočerveně z roztoku (zatím jsem si toho nevšiml) a prý též projasňuje obraz.

4. Voda
Dobrá na odhad barvy výtrusů jako takových - nezaměňovat s barvou výtrusného prachu. Obraz je ve vodě obvykle mlhavý - možná bych měl používat destilovanou vodu.

5. Šampón - dětský hustý
Doporučuje Mat60 (ten má tuším favorita v kopřivovém ). Podobné vodě, ale obraz je obvykle čistší. Zmrazení pohybu jsem však obvykle bohužel nezaznamenal.

6. Bavlníková modř v laktofenolu - Lactophenol Cotton Blue
Přijde mi nezbytný neb pouze v něm jsou obvykle perfektně vidět případná septa. Jinak platí to co u Melzera - když okraje trochu zaschnou, tak se výtrusy téměř přestanou hýbat.

7. Pohyb výtrusů
Pro focení je to noční můrou, ale pro pozorování je to super. Když se navíc podaří, že výtrusy putují z jedné strany na druhou a "válejí přitom sudy", tak si člověk krásně prohléne jak přesně vypadají a jaký mají tvar. U statických je to občas hádankou.

Problém, který mne zatím nejvíce trápí je, jak získat výtrusný prach u malých plodnic, které rychleji zasychají nežli práší výtrusy. Budu zkoušet nějakou komoru nasycenou vodou, případně vlhčení plodnic přes piják shora (viděl jsem i řešení ponořením třeně do vody, ale to třeba ascomycety často nemají nebo to není realizovatelné). Taky chci zkusit omýt plodnice, ale to je použitelné buď při velkém počtu plodnic a nebo pouze vodou, aby nebyla poškozena plodnice pro uložení do herbáře.


To je zatím asi vše

[novotmil]

Myslím Bobe, že jsi za tu dobu co jsis ten mikroskoop pořídil udělal řádný pokrok a budu se těšit na tvoje další fotografie z mikroskopického světa.
Paráda a držím ti palce.

[Bob]

óóó děkuji !!! Stále si však připadám jak totální nemehlo. Všechno je tak trochu trikovatý a chce to něco, co jsem se zatím nikde nedočetl a tak zkouším a zkouším a zkouším a ...

[mat60]

Snažiš se a občas se ti podaří fakt pěkné mikroobrázky. S tou přípravou a barvením preparátů to asi vždy a pořád bude jenom experiment, metoda pokus - omyl. Mám dojem, že nic univerzálního ani nemůže existovat.

[Bob]

Tento týden jsem slavil několi "objevů" jak na výtrusy malých houbiček. Definujme malá houbičky jako ty s kloboučkami pod 10 mm. Metody mám hnedle dvě.

1. Vymáchá se pár plodniček v kapičce vody či vodné kongočervěně a podobně, no a kapalina se pak nanesena sklíčko a udělá se roztěr. Funguje to vcelku dobře.

2. To se mi povedlo včera. Vezmul jsem plodničku chlupáčka (2 mm průměr) a položil výtrusným rouškem na kapku vody na podložním sklíčku. Za několik desítek? minut se voda odpařila. Plodničku jsem odstranil a na místo kde byl jsem kápnul bavlníkovou modř v laktofenolu a přeložil krycím sklíčkem. Výsledek mne velmi mile překvapil. Nejen, že tam bylo značné množství výtrusů, ale též mnoho parafýz a vřecek. Tohle budu rozhodně zkoušet častěji.

[novotmil]

Tak to je Bobe parádní informace - včera jsem se pral s hlavičkou míhavky kmenové a nějak se mi nedařilo - díky.

[Bob]

Držím palce!

[Bob]

A ještě jeden trik ... čekáte-li na výtrusný prach houbiček s malými kloboučky, může se stát, že vyschne dříve než neco vypráší. Tedy spíše než toho vypráší tolik, aby se dala určit i barva výtrusného prachu. Vcelku v pohodě to jednou povedlo ve vlhké komoře (zatím jsem neopakoval). Takže, do nějaké misky vložím vrstvu buničiny a nasytím ji vodou. Na vlhkou buničinu položím podložní sklíčka a na něj klobouček houbičky. Přiklopím skleněným (není asi nutné sklo) poklopem abych minimalizoval vysychání a čekám. Ráno tam asi bude. Může se stát, že pod kloboučkem houby se vytvoří kapičky vody ... po vyndání z vlhka velmi rychle uschnou a lze tak pozorovat i barevné změny výtrusného prachu v závislosti na vysychání. Velmi se mi (z jiných pokusů) osvědčilo, že pokud čekám na výstrusy z něčeho malého, tak je dobrá si nějakou fixou označit, kde houba ležela. Pokud je totiž výtrusný prach bezbarvý nebo je ho málo ... pokud hrajete s výtrusy na schovávanou, pak počítejte s tím, že budete velmi často prohrávat

[Bob]

Tak jo, než se podělím o jednu svojí novou vychytávku, tak jen poznamenám, že překlopení kousku askomycetu na kapku až tři kapky vody, dá po několika minutách velmi dobré množství výtrusů. Často jsem totiž viděl jak v preparátech askomycetů ve vodě vystřelují zralá vřecka výtrusy do vody. Akorát nemám CCD kameru abych to natočil. Pokud je askomycet zralý tak ve vodě je ochotně vystřelí.

Problém: Často si tímto způsobem vnesu spoustu různého "písku" a sklíčko pak nejde přitlačit aby se to moc nehýbalo. Na pozorování ok, ale na focení to prostě není Nemá někdo trik jak to "zrní" z preparátu odstranit? Teď mne napadlo, jestli by nešla použít svíčka či nějaký kus vosku, do kterého by se písek zaseknul, zatímco výtrusy by více méně zůstaly. Tož kdo to zkusí první?

No a teď k té novince. Znáte takové ty igelitové pytlíky se "zipem". Super věc na vzorky z lesa, ikdyž já mám tedy raději bytelné plastové krabičky s víčkem. Ale nejen to! Jedna velká řasnatka mi prášila jen velmi zvolna - potřeboval jsem jí dát čas. No a aby nevyschla ... Vzal jsem igelitový pytlík se zipem a dal tam podložní sklíčko, na ní řasnatku a vedle kus mokré vaty, a zavřel zip. Pokud je to něčím pevným podložené, tak se to dá i přemístit do chladnějších prostor. Během 24 hodin krásně naprášila a zůstala zcela čerstvá. Myslím, že to bude fungovat na mnoha houbách. A navíc, výtrusy vám nelítají po bytě, protože jsou pěkně zavřené v pytli Takže to navíc naše lepší polovičky snesou v lednici mezi jídlem!

[wenca]

chystam se na nějakou tu mikroskopii hub ve škole a chtěl bych se zeptat:

1) co všechno vlastně se dá určit z mikroskopování výtrusného prachu??

2) je nějaký problém, pokud se výtrusného prachu na podložní sklíčko nanese moc a jaké je vlastně ideální množštví?

3) když nechám houbu "vyprášit" na papír, a poté výtrusný prach budu seškrabovat na podložní sklíčko, můžou se nějak poškodit výtrusy? Popřípadě jak teda postupovat...

Díky

[Bob]

Tož tedy zkusím něco odpovět/napovědět